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Empreinte à la DNase

La technique d'empreinte à la DNase (ou DNase Footprinting assay) est une technique de biologie moléculaire permettant d'identifier le site de liaison d'une protéine sur l'ADN.

Empreinte DNaseI d'une protéine se liant à un fragment d'ADN radiomarqué. Les pistes « GA » et « TC » sont des pistes de séquençage chimique Maxam-Gilbert, voir Séquençage de l'ADN. La piste étiquetée « contrôle » est destinée à des fins de contrôle de qualité et contient le fragment d'ADN mais non traité avec DNaseI.

Historique et utilité modifier

La technique de l'empreinte à la DNase I a été mise au point en 1977 par Galas et Schmitz[1]. C'est une méthode de biologie moléculaire destinée à identifier le site de liaison d'interaction entre une protéine et l'ADN pour les protéines de laison à l'ADN[2],[3]. Cette technique a la particularité de permettre d'étudier des liaisons à l'ADN spécifique y compris pour des protéines rares qui ne sont que partiellement purifiées et dans des conditions de bruit de fond important[1].

Cette méthode d'identification des sites de liaisons à l'ADN des complexes Protéines-ADN a démontré son utilité en caractérisant l'activité de nombreux facteurs de transcription et de protéines régulatrices tels que le Facteur de transcription IIIA (GTF3A), le Facteur de Transcription Sp1 (en), la glycoprotéine DF3 qui contrôle la régulation de MUC1[4] et bien d'autres protéines se liant aux promoteurs et notamment celles se liant aux boîtes TATA[1].

Parmi les avantages de cette méthode, on note aussi la possibilité d'identifier des sites de liaisons à l'ADN impliquant de multiples interactions et protéiques[5]. Parmi les inconvénients de cette technique figure le fait qu'une forte occupation du site de liaison est nécessaire pour le résultats soit certain, le temps nécessaire à sa mise en œuvre et la nécessité d'avoir une bonne expérience technique[5]. D'autres méthodes capables d'identifier ou de visualiser les interactions protéines-ADN incluent l'interférence par méthylation, l'empreinte par radical hydroxyle et la technique EMSA[6].

Technique modifier

Dans cette technique in vitro[7], des fragments d'ADN double-brins sont d'abord marqués par radioactivité à leurs extrémités 5'[5],[2],[8] (souvent par le Fragment de Klenow)[6]. Ensuite un premier échantillon contient les fragments d'ADN marqués ainsi que la protéine dont on veut identifier le site de liaison à l'ADN[5]. Dans un deuxième échantillon il n'y a que les fragments d'ADN marqués[2]. Un traitement à la DNase en condition douce est ensuite réalisé (la condition douce permet une seule et unique coupure au niveau de l'ADN, sur un seul brin[7], ce qui permettra une séparation sur gel, base par base)[9]. Lorsque la protéine est fixé à l'ADN il n'y a pas de coupure possible sur la séquence de l'ADN où la protéine est fixée, on dit que l'ADN est protégé sur cette région de la dégradation à la DNase par la protéine[5],[2],[8].

On réalise ensuite un gel d’électrophorèse sur gel polyacrylamide et la migration des échantillons sur ce gel permet de visualiser les séquences nucléotidiques de l'ADN radiomarqué, base par base, grâce à une autoradiographie[5],[2],[6]. Le brin coupé qui reste non marqué sera non visible sur l'autoradiographie[4].

La migration en parallèle de l'échantillon avec la protéine et de celui sans la protéine permet d'observer un «trou» dans le résultat de séquençage, on parle d'une empreinte (ou footprint). Cette empreinte correspond à la séquence ADN de liaison à la protéine que l'on peut comparer avec le témoin sans ajout de protéines pour identifier la séquence complète de liaison[2]. La lecture des bases permettra donc de connaître la séquence exacte du site de liaison[7].

Références modifier

  1. ↑ a b et c Dynan 2012, p. 75.
  2. ↑ a b c d e et f King, Mulligan et Stansfield 2013, p. 130.
  3. ↑ Revzin 2014, p. 1.
  4. ↑ a et b Michov 2022, p. 336.
  5. ↑ a b c d e et f Dynan 2012, p. 76.
  6. ↑ a b et c Adolph 1996, p. 288.
  7. ↑ a b et c Tagu et Moussard 2003, p. 98.
  8. ↑ a et b Revzin 2014, p. 2.
  9. ↑ Revzin 2014, p. 79.

Bibliographie modifier

  • Publication originale (en) DJ Galas et A Schmitz, « DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity », Nucleic Acids Research, vol. 5, no 9,‎ , p. 3157–70 (PMID 212715, PMCID 342238, DOI 10.1093/nar/5.9.3157)
  • (en) Kenneth W. Adolph, « Footprinting Tachniques : Steps on DNA Ladder. DNase Footprinting », dans Human Molecular Genetics, Elsevier Science, , 500 p. (ISBN 9780080536415, présentation en ligne), p. 288-289
  • Denis Tagu et Christian Moussard, « Fiche 32. Empreinte à la DNase I (Footprinting) », dans Principes des techniques de biologie moléculaire, Quae, , 2e éd., 176 p. (ISBN 9782759214594), p. 98-99
  • (en) William S. Dynan, « DNase I footprinting as an assay for mammalian gene regulatory proteins », dans Jane Setlow, Genetic Engineering : Principles and methods, vol. 9, Springer US, , 292 p. (ISBN 9781468453775, présentation en ligne), p. 75-87
  • (en) Robert C. King, Pamela K. Mulligan et William D. Stansfield, « DNase footprinting », dans A Dictionary of Genetics, New York, Oxford University Press, , 8e éd., 641 p. (ISBN 9780199766444, présentation en ligne), p. 130
  • (en) Arnold Revzin, Footprinting of Nucleic Acid-Protein Complexes, Elsevier Science, , 193 p. (ISBN 9781483295015, présentation en ligne)
  • (en) Budin Michov, « 3.1.3.4 DNase Footprinting assay », dans Electrophoresis Fundamentals : Essential Theory and Practice, De Gruyter, , 521 p. (ISBN 9783110761641, présentation en ligne), p. 336

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