Souris knock-out

Les souris knock-out sont des souris domestiques (Mus musculus) qui ont été génétiquement modifiées pour inactiver un ou plusieurs gènes dans les cellules souches embryonnaires dont elles sont issues. Ces cellules souches étant pluripotentes, elles sont donc toutes initialement identiques mais une fois réimplantées dans un blastocyste, peuvent former l'ensemble des types cellulaires d'une souris qui porteront alors la mutation introduite. Il faut distinguer le knock-out d'une simple recherche de mutants. Le knock-out est une mutagenèse ciblée dans la mesure où elle n'altère que la séquence du gène étudié.

Souris knock-out.

Les souris sont actuellement l'espèce animale de laboratoire la plus proche de l'être humain pour laquelle la technique de knock-out peut être facilement appliquée. Elles sont largement utilisées dans les expériences de knock-out, en particulier celles qui étudient des questions génétiques liées à la physiologie humaine. Le knock-out de gènes chez le rat est beaucoup plus difficile et n'a été possible qu'à partir de 2003.

Utilisation

Une souris de laboratoire dont un gène affectant la croissance des poils a été inactivé (à gauche) est présentée à côté d'une souris de laboratoire normale.

Inactiver l'activité d'un gène fournit des informations sur ce que ce gène fait normalement. Les humains partagent de nombreux gènes avec les souris. Par conséquent, observer les caractéristiques des souris knockout (souris dont un gène a été inactivé) donne aux chercheurs des informations qui peuvent être utilisées pour mieux comprendre comment un gène similaire peut causer ou contribuer à une maladie chez l'humain.

Parmi les exemples de recherche dans lesquels les souris knockout ont été utiles, on trouve l'étude et la modélisation de différents types de cancer, d'obésité, de maladies cardiaques, de diabète, d'arthrite, de toxicomanie, d'anxiété, de vieillissement et de la maladie de Parkinson. Les souris knockout offrent également un contexte biologique et scientifique dans lequel des médicaments et d'autres thérapies peuvent être développés et testés.

Des millions de souris knockout sont utilisées dans des expériences chaque année.

Intérêt de cette procédure

Il est particulièrement intéressant, pour les biologistes étudiant le rôle d'un gène particulier, de « supprimer » celui-ci afin d'observer les conséquences physiologiques et cytologiques d'une telle suppression. Le but de la procédure de knock-out est donc d'étudier les effets d'un gène sur un organisme entier par son absence ou par son absence de fonctionnement, par exemple pour l'essai de médicaments thérapeutiques. L'interprétation est cependant délicate lorsque des gènes membres de famille multigéniques se compensent mutuellement et ainsi la mutation knock-out d'un seul d'entre eux peut n'avoir que des effets mineurs. Il faut alors faire des doubles ou des triples knock-out pour observer un effet important (cas des gènes Hox par exemple).

Étapes du protocole

Description générale

Le protocole visant à mettre au point une souris Knock-out suit un déroulement précis. Tout d'abord il faut disposer de la séquence du gène que l'on veut supprimer. Celle-ci permettra de construire un plasmide approprié s'insérant par recombinaison homologue et de manière spécifique dans le génome de l'organisme cible, c'est-à-dire au locus précis du gène à supprimer.

Cette procédure est effectuée in vitro sur des cellules embryonnaires souches (cellules ES). Les cellules qui ont inséré l'ADN exogène à la place de l'ADN endogène par recombinaison homologue sont sélectionnées (voir ci-dessous), puis réintroduites dans un blastocyste qu'on réimplante dans une souris mère-porteuse. L'organisme obtenu sera donc un organisme mosaïque dans le sens où toutes ses cellules n'auront pas le même génome pour le gène considéré (certaines cellules étant issues du blastocyste receveur et certaines cellules provenant des cellules ES mutantes introduites).

La seconde étape du processus consiste à réaliser un croisement entre ces individus appelés G0 et un individu de phénotype « sauvage ». Les individus G1 issus de ce croisement n'hériteront du gène inactivé que dans le cas où la (ou les) cellule(s) souche(s) modifiée(s) ont engendré la lignée germinale des G0. Dans ce cas, 50 % des individus G1 seront hétérozygotes (KO/Sauvage) pour le gène considéré. Afin d'obtenir des homozygotes KO/KO (but de l'expérience), il faut croiser entre eux ces individus G1 entre eux, et l'on observera alors 25 % d'individus G2 homozygotes KO/KO. Par comparaison avec un groupe témoin, on peut alors procéder à l'étude fonctionnelle de ces souris KO, qui ont deux copies inactives pour le gène d'intérêt.

Sélection des cellules ES mutantes

Ce protocole nécessite de pouvoir cribler les cellules ES possédant un exemplaire KO du gène. Le plus souvent, on incorpore au plasmide, entre les deux séquences homologues du gène cible, un gène étranger de résistance à un agent délétère (par exemple la néomycine).

Il faut pouvoir sélectionner les individus chez qui seule la séquence homologue entre plasmide et gène cible a été insérée (double enjambement nécessaire), ce qui est rendu possible par l'incorporation dans une autre région du plasmide d'un gène étranger de sensibilité à un agent délétère (qui permettra de cribler les cellules ayant incorporé le plasmide entier, et donc de les supprimer).

Perspectives

Cette méthode nécessite plusieurs mois et coûte très cher aux laboratoires, amenant ainsi la création de laboratoires commerciaux exclusivement spécialisés pour concevoir ces animaux expérimentaux.

Les souris ne sont pas les seuls organismes pouvant faire l'objet d'un knock-out : tout organisme, potentiellement, peut voir l'un de ses gènes inactivé par cette technique.

Articles connexes

• Souris Kaguya

Liens externes

• Ressources relatives à la santé :
  • Medical Subject Headings
  • Store medisinske leksikon
• Notice dans un dictionnaire ou une encyclopédie généraliste :

  • Britannica

• « L'invalidation d'un gène : le « knock-out » », sur le site de l'Université de Jussieu
• International Knockout Mouse Consortium