Southern blot

Le Southern blot ou southern blot (également appelé transfert d'ADN ou buvardage de Southern) est une méthode de biologie moléculaire permettant l'analyse de l'ADN. Elle a été inventée en 1975 par Edwin Southern, un professeur britannique de biologie moléculaire.

C'est ce nom (Southern blot) qui a, par jeu de mots, inspiré l'appellation d'autres techniques : western blot, northern blot et far-eastern blot.

Principe

Partant de fragments d'ADN obtenus par l'action d'enzymes de restriction, la technique du transfert de Southern est appliquée afin de rechercher parmi ces fragments, ceux qui portent des séquences particulières. Pour cela, les biologistes utilisent des sondes nucléotidiques. Les sondes sont constituées, dans le cas du Southern, d'un fragment d'ADN comportant des bases dites « marquées », soit par port d'atomes radioactifs, soit par port d'éléments fluorescents ou d'anticorps. On recherche par hybridation (c'est à dire en se fondant sur des homologies de séquence) les fragments d'ADN sur lesquels la sonde se fixera. Le transfert de Southern sert donc à repérer des fragments d'ADN porteurs de séquences remarquables.

D'une façon plus générale, les fragments d'ADN issus de l'action des enzymes de restriction peuvent présenter des polymorphismes de restriction. Un polymorphisme de restriction est une variation individuelle de la séquence des bases du génome modifiant un ou plusieurs sites de restriction. Ces polymorphismes de restriction, caractéristiques de mutations, ont un grand intérêt pour déterminer des variations géniques, par exemple dans le cas de tests de paternité.

Méthode

Gel prêt à être utilisé.

Membrane après hybridation et lavage.

1. L'ADN est digéré par les enzymes de restriction.
2. Les fragments d'ADN ainsi produits sont placés dans les puits d'un gel d'électrophorèse (gel d'agarose).
3. Le gel est alors mis dans une cuve horizontale contenant une solution tampon et deux électrodes (+ et -). On procède alors à une migration sous l'action d'un courant continu.
4. Une fois la migration effectuée, on trempe le gel (contenant les fragments d'ADN) dans une solution de bromure d'éthidium (BET).
5. Révélation des fragments d'ADN sous rayons UV.
6. Le gel d'électrophorèse est ensuite trempé dans une solution alcaline (contenant habituellement de l'hydroxyde de sodium ou plus communément « soude ») afin de permettre la dénaturation de l'ADN bicaténaire (séparation de l'ADN double-brin en simple-brin). Le BET s'intercalant entre les deux brins d'ADN, cette étape a aussi pour effet de séparer le BET de la molécule d'ADN.
7. Une membrane en nitrocellulose (ou encore en nylon) est placée sur le gel et l'ensemble est lui même placé sur une feuille de papier buvard alimentée par une solution saline tamponnée. Au dessus de la membrane, des éléments absorbants sont ajoutés, tels que papier buvard ou serviettes de papier. Le tout est surmonté d'une masse permettant d'assurer un contact parfait entre le buvard alimentant en solution tamponnée, le gel et la membrane de transfert. Ce montage induit le déplacement de l'ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité. L'ADN se déposer alors sur la membrane.
8. La membrane est alors modérément chauffée dans le cas de nitrocellulose, ou exposée au rayonnement ultraviolet s'il s'agit de nylon, afin de fixer de manière permanente l'ADN sur la membrane (formation de liaisons covalentes entre l'ADN et la membrane).
9. La membrane est ensuite mise en contact avec une sonde spécifique de la séquence d'ADN recherchée (fragment d'ADN complémentaire de la séquence ciblée) à une température contrôlée, pendant plusieurs heures. La sonde est au préalable marquée de sorte qu'elle puisse être détectée, soit par incorporation de radioisotopes ou par « étiquetage » de la molécule avec un fluorophore ou un antigène tel que la digoxygénine. Dans certains cas, la sonde peut être produite à partir d'ARN marqué, plutôt que d'ADN.
10. Après hybridation, la sonde en excès est éliminée de la membrane par lavages, et l'hybridation est visualisée par autoradiographie, dans le cas d'une sonde radioactive ou fluorescente.

Résultat

La sonde hybridée révèle la position sur la membrane des fragments d'ADN recherchés.

Dans le cas de recherche de polymorphisme, plusieurs situations peuvent se présenter :

• Les fragments d'ADN sont semblables au lieu d'hybridation de la sonde et à proximité de celui-ci et les fragments sont de même taille : il n'y a pas de polymorphisme.

• Un site de restriction au voisinage de la sonde n'est présent que chez l'un des deux individus ; les fragments n'ont pas la même taille et ne sont donc pas à la même hauteur sur le gel : il y a polymorphisme de sites de restriction.

• Les sites de restriction sont identiques, mais une séquence supplémentaire est présente chez l'un des deux fragments. Les vitesses de migration des fragments et donc leur position sur le gel sont donc, ici aussi, différentes : il y a polymorphisme d'insertion/délétion.

Voir aussi

• Northern blot
• Western blot

Liens externes

• Animation expliquant la technique