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Unité formant colonie

En microbiologie, une unité formant colonie ou unité formatrice de colonie (UFC) est utilisée pour estimer le nombre de bactéries ou de cellules fongiques viables dans un échantillon. La viabilité est définie comme la capacité de se multiplier via la fission binaire dans des conditions contrôlées. Le comptage d'UFC nécessite la culture des microorganismes et ne porte que sur les cellules viables, contrairement à d'autres analyses telles que la microscopie à épifluorescence ou la cytométrie en flux (qui compte toutes les cellules, vivantes ou mortes). L'apparition d'une colonie visible à l'œil nu dans une culture cellulaire nécessite une croissance importante, et lors du comptage des colonies, il n'est pas certain que la colonie soit issue d'une seule cellule (elle peut l'être d'un groupe de cellules). L'expression des résultats en UFC reflète cette incertitude.

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Théorie

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Une dilution faite avec des bactéries et de l'eau peptonée est placée dans une plaque d'agar (gélose pour numération en plaque ou agar plate count en anglais) pour les échantillons d'aliments ou gélose Trypticase soja pour les échantillons cliniques) et répartie sur la plaque en basculant dans le modèle illustré.

Le dénombrement sur gélose a pour but d'estimer le nombre de cellules présentes en fonction de leur capacité à donner naissance à des colonies dans des conditions spécifiques de milieu nutritif, de température et de temps. Théoriquement, une cellule viable peut donner naissance à une colonie par réplication. Cependant, les cellules solitaires sont une exception dans la nature, et il se peut que la colonie soit originaire d'une masse de cellules déposées ensemble ou physiquement proches[1]. De plus, de nombreuses bactéries se développent en chaînes (comme Streptococcus) ou en amas (par exemple Staphylococcus). L'estimation du nombre de cellule par le comptage des UFC sous-estimera, dans la plupart des cas, le nombre de cellules vivantes présentes dans un échantillon pour ces raisons. En effet, le comptage des UFC suppose que chaque colonie soit séparée et fondée par une seule cellule microbienne viable[2].

Pour E. coli, le comptage est linéaire sur une plage de 30 à 300 UFC sur une boîte de Petri de taille standard[3]. Par conséquent, pour garantir que le nombre d'UFC dans un échantillon sera compris dans cette plage, il faut le diluer et ensemencer plusieurs dilutions sur plusieurs boîtes. Généralement, on utilise des dilutions d'un facteur 1/10 et la série de dilutions est ensemencée en 2 ou 3 réplicats sur la plage de dilutions choisie. Le nombre d'UFC/boîte est lu à partir d'une boîte dont le nombre d'UFC se trouve en zone linéaire, puis le nombre d'UFC/g (ou UFC/mL) de l'échantillon de départ est déduit mathématiquement en tenant compte du nombre de boîtes et de leur facteur de dilution[4].

Une solution de bactéries à une concentration inconnue est souvent diluée par suspension-dilution afin d'obtenir au moins une boîte avec un nombre dénombrable de bactéries. Sur cette figure, la boîte "x10" convient au comptage.

Un avantage de cette méthode est que différentes espèces microbiennes peuvent donner naissance à des colonies qui sont clairement différentes les unes des autres, à la fois microscopiquement et macroscopiquement. La morphologie des colonies peut être d'une grande utilité pour l'identification du micro-organisme présent[5].

Une connaissance préalable de la morphologie microscopique de l'organisme peut améliorer la compréhension du lien entre le nombre d'UFC/mL observé et le nombre de cellules viables par millilitre. Par ailleurs, il est parfois possible de diminuer le nombre moyen de cellules par UFC en vortexant l'échantillon avant de le diluer. Cependant, de nombreux micro-organismes sont fragiles et peuvent subir une perte de viabilité s'ils sont soumis à ce traitement[6].

Notation logarithmique

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Les concentrations d'unités formant colonie peuvent être exprimées en utilisant la notation logarithmique, qui consiste à indiquer le logarithme décimal du nombre d'UFC par millilitre (concentration volumique) ou par gramme (concentration massique)[7],[8],[9]. Cela permet d'exprimer comme une simple soustraction la diminution du nombre d'UFC au terme d'un processus de décontamination.

Utilisations

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Les unités formant colonies sont utilisées en microbiologie pour quantifier les résultats de différentes méthodes de comptage et d'ensemencement sur gélose :

  • La méthode d'ensemencement en masse dans laquelle l'échantillon est mis en suspension dans une boîte de Petri en utilisant de la gélose fondue refroidie à environ 40-45 °C (juste au-dessus du point de solidification pour minimiser la mort cellulaire induite par la chaleur). Une fois la gélose solidifiée, la plaque est incubée[10].
  • La méthode d'ensemencement en surface dans laquelle un petit volume d'échantillon est étalé à la surface d'une gélose et laissé sécher avant l'incubation pour le comptage[10].
  • La méthode de filtration sur membrane dans laquelle l'échantillon est filtré à travers une membrane filtrante, puis le filtre placé à la surface d'un milieu gélosé (côté bactéries vers le haut). Pendant l'incubation, les nutriments traversent le filtre et nourrissent les cellules en croissance. Comme la surface de la plupart des filtres est inférieure à celle d'une boîte de Petri standard, la plage linéaire permettant le dénombrement sera moins grande[10].
  • La méthode de Miles et Misra (en) (en anglais drop-plate method) qui consiste à déposer un très petit volume de chaque dilution, environ 10 µL, à la surface d'une gélose. La lecture doit être très précoce, tant que les colonies sont encore très petites, pour éviter une sous-estimation du nombre d'UFC due la confluence de colonies voisines au cours de leur croissance[11].

Ces techniques nécessitent l'emploi d'une gélose et sont irréalisables en milieu liquide, d'une part car il ne serait pas possible de vérifier la pureté des cultures et d'autre part en raison des difficultés liées au dénombrement de cellules viables dans un liquide[12].

Outils de dénombrement des colonies

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Manière traditionnelle d'énumérer les UFC avec un "compteur de clics" et un stylo. Lorsque les colonies sont trop nombreuses, il est courant de ne compter les UFC que sur une fraction de la boîte.

Le dénombrement des colonies est traditionnellement effectué à la main à l'aide d'un feutre et d'un compteur manuel. Il s'agit généralement d'une tâche simple, mais elle peut devenir très fastidieuse lorsqu'il y a de nombreuses plaques à traiter. La pénibilité de cette tâche fait l'intérêt des différentes solutions semi-automatiques (logiciels) et automatiques (matériel + logiciel) existantes.

Logiciels

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Plusieurs logiciels sont capables de dénombrer les colonies à partir de simples photographies des cultures. L'opérateur photographie toutes les boîtes dont il a besoin pour réaliser le calcul (un appareil photo numérique ou même une webcam suffisent) et analyse ensuite les images. À raison de moins de 10 secondes par photographie, contre plusieurs minutes par boîte pour le comptage manuel, cette approche permet un gain de temps considérable. De plus, elle est plus objective et permet d'extraire d'autres variables telles que la taille et la couleur des colonies.

En voici trois exemples :

  • OpenCFU est un programme gratuit et open-source conçu pour optimiser la facilité d'utilisation, la vitesse et la fiabilité. Il offre une large gamme de filtres et de commandes ainsi qu'une interface utilisateur moderne. OpenCFU est écrit en C++ et utilise OpenCV pour l'analyse d'images[13]
  • NICE est un programme écrit en MATLAB qui permet de compter facilement les colonies à partir d'images[14],[15]
  • ImageJ et CellProfiler (en) : certaines macros et plugins ImageJ[16] et certains pipelines CellProfiler[17] peuvent être utilisés pour compter les colonies. Cela nécessite souvent que l'utilisateur modifie le code afin d'obtenir un flux de travail efficace, mais peut s'avérer utile et flexible. Un problème majeur est l'absence d'interface graphique spécifique qui peut rendre fastidieuse l'interaction avec les algorithmes de traitement.

En plus des logiciels basés sur des ordinateurs de bureau traditionnels, il existe des applications de comptage semi-automatisé et automatisé des colonies pour les appareils Android et iOS. La caméra intégrée est utilisée pour photographier la gélose, puis un algorithme interne ou externe traite les données graphiques afin d'estimer le nombre de colonies[18],[19],[20],[21].

Systèmes automatisés

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Comme les techniques qui reposent sur le dénombrement manuel de cellules ou de colonies sont associées à un risque d'erreur élevé, beaucoup de systèmes automatisés sont employés pour réduire cette marge d'erreur. Les techniques de comptage manuel basées sur l'utilisation d'une lumière transmise sont courantes mais sujettes aux erreurs, et peuvent avoir une incidence notable sur les concentrations calculées, en particulier lorsque l'échantillon de départ contient peu de cellules[22].

Un compteur de colonies automatisé utilisant le traitement d'image.

Certains fabricants proposent des systèmes de dénombrement entièrement automatisés[23],[24]. Ils sont généralement coûteux et moins flexibles que les logiciels autonomes, car le matériel et les logiciels sont conçus pour fonctionner ensemble dans une configuration spécifique[14]. Certains systèmes automatiques utilisent la technique de l'ensemencement en spirale (en)[25].

Certains systèmes automatisés tels que ceux basés sur MATLAB sont capables de compter des cellules non colorées. Cela permet de réutiliser les colonies pour d'autres expériences sans risque d'exposer les micro-organismes à un colorant toxique. Cependant, un inconvénient de ces systèmes automatisés est qu'il est extrêmement difficile de différencier les micro-organismes de grains de poussière ou de rayures sur gélose au sang, car ces éléments parasites peuvent créer des combinaisons très vériées de formes et d'aspects[26].

Unités alternatives

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Le nombre d'UFC peut être remplacé par d'autres paramètres numériques tels que le nombre le plus probable (en) (NPP)[27] ou les Unités Fishman Modifiées (MFU)[28]. La méthode du nombre le plus probable ne s'applique qu'aux cellules viables et trouve son utilité pour l'énumération de faibles concentrations de cellules ou dans les produits où la présence de particules rend le dénombrement sur gélose peu pratique[29]. Les unités Fishman modifiées tiennent compte des bactéries viables mais non cultivables[30].

Liens externes

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Calculateur d'unités formant des colonies

Notes et références

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  1. ↑ « Bact. 102: The CFU Page », sur www.splammo.net (consulté le )
  2. ↑ Emanuel Goldman et Lorrence H Green, Practical Handbook of Microbiology, Second Edition (Google eBook), USA, Second, , 864 p. (ISBN 978-0-8493-9365-5, lire en ligne)
  3. ↑ « The Number of Colonies Allowable on Satisfactory Agar Plates », Journal of Bacteriology, vol. 1, no 3,‎ , p. 321–31 (PMID 16558698, PMCID 378655, lire en ligne)
  4. ↑ Bio-resource, « Bio-Resource: CFU: Colony Forming Unit & Calculation », sur Bio-Resource, (consulté le )
  5. ↑ (en) Saeedesadat Badieyan, Arezou Dilmaghani-Marand, Mohammad Javad Hajipour, Ali Ameri, Mohammad Reza Razzaghi, Hashem Rafii-Tabar, Morteza Mahmoudi et Pezhman Sasanpour, « Detection and Discrimination of Bacterial Colonies with Mueller Matrix Imaging », Scientific Reports, vol. 8, no 1,‎ , p. 10815 (ISSN 2045-2322, PMID 30018335, PMCID 6050273, DOI 10.1038/s41598-018-29059-5 Accès libre, Bibcode 2018NatSR...810815B)
  6. ↑ Zheng Wang, « Survival of Bacteria on Respirator Filters », Aerosol Science and Technology, vol. 30, no 3,‎ , p. 300–308 (ISSN 0278-6826, DOI 10.1080/027868299304651, lire en ligne, consulté le )
  7. ↑ « Log10 Colony Forming Units per Gram », Titi Tudorancea Encyclopedia (consulté le )
  8. ↑ Daniel Y. C. Fung, « Viable Cell Counts », Bioscience International, (consulté le )
  9. ↑ Martin Cole, « Principles of microbiological testing: Statistical basis of sampling » [archive du ], International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF), (consulté le )
  10. 1 2 3 (en) « USP <61> Test- Microbial Enumeration Test », sur www.accugenlabs.com, (consulté le )
  11. ↑ (en) A. A. Miles, S. S. Misra et J. O. Irwin, « The estimation of the bactericidal power of the blood », Epidemiology & Infection, vol. 38, no 6,‎ , p. 732–749 (ISSN 1469-4409 et 0950-2688, DOI 10.1017/S002217240001158X, lire en ligne, consulté le )
  12. ↑ Reynolds, « Serial Dilution Protocols » [archive du ], www.microbelibrary.org (consulté le )
  13. ↑ Geissmann Q, « OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects », PLoS ONE, vol. 8, no 2,‎ , e54072 (PMID 23457446, PMCID 3574151, DOI 10.1371/journal.pone.0054072)
  14. 1 2 (en) Clarke M. L., Hwang J., Burton R. & Nahm M., « NIST s Integrated Colony Enumerator (NICE) » [PDF], Software-Temporary Site is:,
  15. ↑ « Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies », Cytometry Part A, vol. 77, no 8,‎ , p. 790–7 (PMID 20140968, PMCID 2909336, DOI 10.1002/cyto.a.20864)
  16. ↑ « Optimized digital counting colonies of clonogenic assays using ImageJ software and customized macros: comparison with manual counting », International Journal of Radiation Biology, vol. 87, no 11,‎ , p. 1135–46 (PMID 21913819, DOI 10.3109/09553002.2011.622033)
  17. ↑ « Using CellProfiler for automatic identification and measurement of biological objects in images », Current Protocols in Molecular Biology, vol. Chapter 14,‎ (ISBN 978-0-471-14272-0, PMID 18425761, DOI 10.1002/0471142727.mb1417s82)
  18. ↑ (en-US) « Promega Colony Counter », App Store (consulté le )
  19. ↑ (en) « APD Colony Counter App PRO - Apps on Google Play », play.google.com (consulté le )
  20. ↑ (en) Austerjost, Marquard, Raddatz et Geier, « A smart device application for the automated determination of E. coli colonies on agar plates », Engineering in Life Sciences, vol. 17, no 8,‎ , p. 959–966 (ISSN 1618-0240, DOI 10.1002/elsc.201700056)
  21. ↑ (en-US) « CFU Scope », App Store (consulté le )
  22. ↑ Basil Jarvis, « Errors associated with colony count procedures », Elsevier,‎ , p. 119–140 (ISBN 978-0-12-803973-1, DOI 10.1016/b978-0-12-803973-1.00007-3)
  23. ↑ (en-GB) « Colony Counters: Robotic Colony Counter - Plate Handler », www.neutecgroup.com (consulté le )
  24. ↑ « Fully Automatic Colony Counter by AAA Lab Equipment Video | LabTube », www.labtube.tv (consulté le )
  25. ↑ « Automatic Platers - Laboratory Equipment | INTERSCIENCE », sur www.interscience.com (consulté le )
  26. ↑ Brugger, Baumberger, Jost et Jenni, « Automated Counting of Bacterial Colony Forming Units on Agar Plates », PLoS ONE, vol. 7, no 3,‎ , e33695 (ISSN 1932-6203, PMID 22448267, PMCID 3308999, DOI 10.1371/journal.pone.0033695)
  27. ↑ (en) M. Alexander, « Most Probable Number Method for Microbial Populations », dans Methods of Soil Analysis, John Wiley & Sons, Ltd, (ISBN 978-0-89118-977-0, DOI 10.2134/agronmonogr9.2.2ed.c39, lire en ligne), p. 815–820
  28. ↑ Peter Bernfeld, Helen C. Bernfeld, Jerome S. Nisselbaum et William H. Fishman, « Dissociation and Activation of β-Glucuronidase1 », Journal of the American Chemical Society, vol. 76, no 19,‎ , p. 4872–4877 (ISSN 0002-7863 et 1520-5126, DOI 10.1021/ja01648a035, lire en ligne, consulté le )
  29. ↑ « Bacterial Analytical Manual: Most Probable Number from Serial Dilutions », United States Food and Drug Administration,
  30. ↑ (en) Maximilian Lackner, Wihelm Grabow et Philipp Stadler, Handbook of Online and Near-real-time Methods in Microbiology, CRC Press, , 244 p. (lire en ligne)

Articles connexes

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