Utilisateur:Wikimavi2014/Förster Resonance Energy Transfer

Introduction

Le Förster Resonance Energy Transfer (FRET) est un phénomène de transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes. Le donneur D peut transférer de l'énergie à l'accepteur A de manière non radiative, c'est-à-dire sans émission de photon. Le FRET nécessite une proximité importante entre le donneur et l'accepteur, typiquement de 2 à 9 nm. Ce phénomène a été nommé en hommage à Theodor Förster, qui a été le premier à écrire la formule exprimant l'efficacité du FRET.

Suite à l'excitation du donneur par un photon généralement issue d'un laser, la désexcitation du donneur par fluorescence, selon la probabilité de désexcitation $\gamma _{0}$, est détectée en absence de FRET. Une modification de cette probabilité de désexcitation causée par un transfert d'énergie du donneur à l'accepteur selon la probabilité de transition $\gamma _{D\rightarrow A}$ constitue la signature du FRET. Il s'agit du moyen classiquement utilisé pour mettre en évidence ce phénomène.

Les mesures d'efficacité de FRET trouvent des applications importantes en biologie, notamment car ce phénomène permet de déterminer si deux émetteurs fluorescents sont à une certaine distance l'un de l'autre. Par exemple, cela rend possible l'étude d’interactions entre protéines ainsi que la mise en évidence de changement de conformation de molécules.

Principe physique

Les considérations qui vont suivre sont largement inspirées du livre Principle of nano-optics écrit par Lukas Novotny et Bert Hecht. Dans l'ensemble de ces développements théoriques vont être étudiées les interactions entre deux systèmes, appelés particules. Ces particules peuvent être des atomes ou des molécules. Il est supposé que les interactions entre ces particules ne modifient pas leur structure interne. Ainsi, des phénomènes de nature chimique comme des transferts d'électrons ou des liaisons moléculaires ne sont pas considérées. De plus, il est considéré que la probabilité de transition entre D et A est inférieure à la probabilité de relaxation vibrationnelle. Dans le cas contraire, le donneur et l'accepteur sont fortement couplés, et l'accepteur a de fortes chances de retransférer immédiatement l'énergie reçue au donneur. Il n'est alors plus possible de distinguer un donneur et un accepteur.

Interaction dipôle-dipôle

Le transfert d'énergie par FRET est de nature non radiative, c'est-à-dire qu'il n'induit pas la création d'un photon. Il résulte de l’interaction dipôle-dipôle, qui est présente même entre molécules non chargées.

Deux particules A et B , de densité de charge $\rho _{A}$ et $\rho _{B}$ et séparées par une distance $R$, présentent un potentiel d’interaction, noté $V_{AB}$. Ce potentiel se calcule en intégrant la formule du potentiel de Coulomb sur les domaines correspondant à A et B. Si les particules sont suffisamment petites devant leur distance $R$, il est possible d'évaluer $V_{AB}$ en utilisant les coordonnées de leurs centres de masse ${\boldsymbol {r_{A}}}$ et ${\boldsymbol {r_{B}}}$ pour effectuer un développement de Taylor en ${\boldsymbol {R}}={\boldsymbol {r_{B}}}-{\boldsymbol {r_{A}}}$. Le potentiel d’interaction vaut alors

$V_{AB}({\boldsymbol {R}})={\frac {1}{4\pi \epsilon _{0}}}[{\frac {q_{A}q_{B}}{R}}+{\frac {q_{A}{\boldsymbol {\mu _{B}}}\cdot {\boldsymbol {R}}}{R^{3}}}-{\frac {q_{B}{\boldsymbol {\mu _{A}}}\cdot {\boldsymbol {R}}}{R^{3}}}+{\frac {R^{2}{\boldsymbol {\mu _{A}}}\cdot {\boldsymbol {\mu _{B}}}-3({\boldsymbol {\mu _{A}}}\cdot {\boldsymbol {R}})({\boldsymbol {\mu _{B}}}\cdot {\boldsymbol {R}})}{R^{5}}}+...]\qquad (1)$

avec $q$ la charge de la particule et ${\boldsymbol {\mu }}$ son moment électrique dipolaire. Il est à noter que cette formule n'est valable qu'en champ proche puisque le développement de Taylor a été fait pour ${\boldsymbol {R}}$ proche de 0.

Dans le cas de particules non chargées, vérifiant $q_{A}=q_{B}=0$, les interactions charge-charge et charge-dipôle disparaissent. Le quatrième terme de l'équation (1) correspondant à l'interaction dipôle-dipôle devient dominant. C'est celui qui donne lieu au transfert d'énergie par FRET. Il faut noter que l’interaction dipôle-dipôle décroît selon $R^{-3}$ et dépend fortement de l'orientation des dipôles, à travers le produit scalaire entre les moments dipolaires.

Les termes suivants dans le développement de Taylor correspondent aux interactions faisant intervenir le moment électrique quadrupolaire mais ceux-ci ont un rayon d'action très court et peuvent ainsi être négligés.

Probabilité de transition

La quantité d'énergie transférée entre deux particules non chargées, du donneur D à l'accepteur A, s'exprime communément avec la probabilité de transition ${\gamma _{D\rightarrow A}}$. Il s'agit du nombre de désexcitations de D entraînant l'excitation de A par unité de temps ou, en d'autres termes, le nombre de photons virtuels émis par D et absorbés par A.

La probabilité de désexcitation $\gamma _{0}$ peut être interprétée comme l'inverse du temps de vie de l'oscillateur, c'est-à-dire de la durée $\tau _{0}$ pour laquelle l'énergie du dipôle a baissé de $1/e$. Ce temps est généralement de l'ordre de la nanoseconde. On a alors

$\tau _{0}={\frac {1}{\gamma _{0}}}\qquad (2)$

Les deux particules D et A sont considérées comme des dipôles distants de $R$ et situés dans un milieu d'indice $n$. Ils sont localisés par les vecteurs ${\boldsymbol {r_{D}}}$ et ${\boldsymbol {r_{A}}}$ et ils sont caractérisés par leur moment électrique dipolaire $\mu _{D}$ et $\mu _{A}$, orientés respectivement selon les vecteurs ${\boldsymbol {n_{D}}}$ et ${\boldsymbol {n_{A}}}$. On définit également le vecteur normal de D vers A qui s'écrit ${\boldsymbol {n_{R}}}$.

En supposant une excitation préalable du donneur par un photon d'énergie $E_{D}=\hbar \omega _{0}$, la résolution de l'équation de mouvement du donneur D considéré comme un oscillateur harmonique donne

${\frac {\gamma _{D\rightarrow A}}{\gamma _{0}}}={\frac {P_{D\rightarrow A}}{P_{0}}}\qquad (3)$

Dans cette équation, $\gamma _{0}$ est la probabilité de désexcitation de D en l'absence de A, $P_{0}$ la puissance émise par D en l'absence de A et $P_{D\rightarrow A}$ la puissance émise par D absorbée par A. Pour l'écriture de cette égalité, le rendement quantique $q_{i}$ de l'oscillateur qui modélise le donneur a été supposé égal à 1. L'influence de ce paramètre est discutée ultérieurement.

Il est à noter que seul le rapport entre la probabilité de transition et la probabilité de désexcitation est généralement utilisé pour interpréter les expériences de FRET, mais il est possible d'évaluer la probabilité de transition en utilisant

$\gamma _{0}={\frac {\omega _{0}^{3}\mu _{D}^{2}}{3\pi \epsilon _{0}\hbar c^{3}}}\qquad (4)$ (4)

Les puissances $P_{D\rightarrow A}$ et $P_{0}$ de l'équation (3) peuvent être évaluées en utilisant le vecteur de Poynting. On obtient

${\frac {\gamma _{D\rightarrow A}}{\gamma _{0}}}={\frac {9c^{4}}{8\pi R^{6}}}\int _{0}^{\infty }{{\frac {f_{D}(\omega )\sigma _{A}(\omega )}{n^{4}(\omega )\omega ^{4}}}T(\omega )d\omega }\qquad (5)$

Cette formule est expliquée dans le détail par la suite.

Rayon de Förster

Plus classiquement, la formule (5) s'écrit en fonction du rayon de Förster $R_{0}$, avec

${\frac {\gamma _{D\rightarrow A}}{\gamma _{0}}}=\left[{\frac {R_{0}}{R}}\right]^{6},\qquad R_{0}^{6}={\frac {9c^{4}\kappa ^{2}}{8\pi }}\int _{0}^{\infty }{{\frac {f_{D}(\omega )\sigma _{A}(\omega )}{n^{4}(\omega )\omega ^{4}}}d\omega }\qquad (6)$

Du rayon de Förster dépend l'efficacité du transfert d'énergie entre le donneur et l'accepteur. Pour deux particules D et A séparées par une distance $R=R_{0}$ la probabilité de transition est égale à la probabilité de désexcitation du donneur en l'absence de l'accepteur. Pour de plus grandes distances, le rapport entre probabilité de transition et probabilité de désexcitation évolue selon $R^{-6}$. Ainsi, on le FRET est détectable uniquement pour des distances $R$ proches de $R_{0}$, qui se situe typiquement autour de 2-9 nm. Pour des distances plus grandes que 20 nm, il devient presque impossible de détecter du signal FRET.

Le rayon de Förster décroît fortement avec la pulsation $\omega$ mais aussi avec l'indice du milieu $n(\omega )$. Ainsi, la valeur de $R_{0}$ change lorsque les particules sont dans des solvants différents. La dépendance de $R_{0}$ selon les autres paramètres $\kappa$, $f_{D}(\omega )$ et $\sigma _{A}(\omega )$ fait l'objet des sections suivantes.

Spectre d'émission et section efficace d’absorption

Dans la formule (6), le spectre d'émission du donneur D intervient sous la forme du spectre d'émission normalisée $f_{D}(\omega )$. Il s'agit du rapport entre l'énergie émise à la pulsation $\omega$ et l'énergie totale émise.

La section efficace d'absorption de A intervient également dans cette formule. Celle-ci se définit par

$\sigma _{A}(\omega )={\frac {\langle P(\omega )\rangle }{I(\omega )}}\qquad (7)$

Il s'agit ainsi du rapport entre la puissance $\langle P(\omega )\rangle$ absorbée par A moyennée sur toutes les orientations des dipôles et l'intensité incidente sur A notée $I(\omega )$. Cette valeur est donc comprise entre 0 et 1, et quantifie l'efficacité avec laquelle A absorbe le rayonnement qui l'atteint.

Le rayon de Förster dépend de l'intégrale sur toutes les pulsations du produit de $f_{D}(\omega )$ et de $\sigma _{A}(\omega )$, c'est-à-dire du recouvrement spectral entre le spectre d'émission du donneur et la section efficace d'absorption de l'accepteur. Il faut en effet une compatibilité entre ces deux spectres pour que les photons virtuels émis par D puissent être absorbés par A.

Orientation relative donneur-accepteur

La position et l'orientation relative du couple donneur-accepteur interviennent à travers la fonction $T(\omega )$ dans l'équation (5). Cette fonction est compliquée et dépend en particulier de la distance entre D et A à la puissance 6, ainsi que de la fonction de Green ${\overleftrightarrow {\boldsymbol {G}}}{\boldsymbol {(r_{D},r_{A})}}$ qui exprime le champ électrique reçu par un dipôle A provenant d'un dipôle D. Pour des environnements homogènes, cette fonction de Green peut être exprimée analytiquement et on utilise $\kappa$ dans l'équation (6) pour exprimer la dépendance du FRET à l'orientation des dipôles. Il s'exprime par

$\kappa ^{2}=[{\boldsymbol {n_{A}}}\cdot {\boldsymbol {n_{D}}}-3({\boldsymbol {n_{R}}}\cdot {\boldsymbol {n_{D}}})({\boldsymbol {n_{R}}}\cdot {\boldsymbol {n_{A}}})]^{2}\qquad (8)$

La valeur de ce paramètre est comprise dans l'intervalle $\kappa ^{2}$ = [0...4]. Cependant, lorsque les orientations relatives des dipôles sont inconnues, il est courant d'utiliser la valeur de $\kappa ^{2}$ moyennée sur toutes les orientations, qui vaut

$\langle \kappa ^{2}\rangle ={\frac {2}{3}}\qquad (9)$

Cette approximation peut être un facteur d'erreur important, surtout dans les expériences faisant intervenir un seul donneur et un seul accepteur. Il est alors nécessaire de connaître l'orientation des dipôles pour s'en affranchir.

Le FRET est modifié par des environnements inhomogènes, comme dans les cas des microcavité optique, qui sont des structures dont les dimensions sont proches des longueurs d'onde de l'optique. Dans ce cas, il est nécessaire d'effectuer les calculs avec $T(\omega )$ et de prendre en compte les inhomogénéités en utilisant une fonction de Green ${\overleftrightarrow {\boldsymbol {G}}}{\boldsymbol {(r_{D},r_{A})}}$ modifiée.

Rendement quantique

L'énergie d'une particule à un état excité peut être dissipée radiativement ou non radiativement. L'émission de photons est caractéristique d'un retour à l'équilibre de manière radiative. Dans le cas non radiatif, l'énergie peut être dissipée par transfert de vibrations à d'autres molécules couplées à la particule, par extinction causée par d'autres molécules, par transfert d'énergie à l'environnement...

Dans le cas général, le rendement quantique intrinsèque $q_{i}$ est défini comme la fraction d'énergie dissipée radiativement par un oscillateur. Il a une valeur entre 0 et 1 et, pour $q_{i}=1$, toute l'énergie de l'oscillateur est dissipée par radiations. Le rendement quantique $Q$ est défini de la même manière mais caractérise la particule réelle.

Dans le cas d'un environnement homogène, le rendement quantique intrinsèque $q_{i}$ de l'oscillateur et le rendement quantique </math>Q</math> de la particule sont égaux, et on a

$q_{i}=Q={\frac {\gamma _{r}}{\gamma _{r}+\gamma _{nr}}}\qquad (10)$

avec $\gamma _{r}$ et $\gamma _{nr}$ les probabilités de désexcitation radiative et non radiative.

Le rendement quantique $Q$ du donneur en l'absence de l'accepteur influe sur le rendement du FRET. En effet, la différence entre le signal émis par le donneur seul, c'est-à-dire sans FRET, et le signal émis par le donneur en présence de l'accepteur, c'est-à-dire avec FRET, sera d'autant plus marquée si le donneur seul est un bon émetteur, c'est-à-dire pour $Q$ proche de 1.

L'environnement joue un rôle important sur la valeur de $Q$. Par exemple, la proximité de la particule avec un métal noble modifie sa valeur. Pour des distances supérieures à 5 nm, la présence de la surface métallique augmente la valeur de $Q$ alors qu'elle diminue sa valeur pour de faibles distances. La surface est alors appelée désactivateur car elle cause l'extinction de la molécule fluorescente.

Détection

Il existe plusieurs moyens techniques pour détecter le FRET et caractériser son efficacité. Les mesures d'intensités et de temps de vie restent les plus communs. Des méthodes utilisant les propriétés de photoblanchiment des émetteurs fluorescents sont également utilisées.

Intensité de fluorescence

Le FRET provoque une diminution de l'intensité de fluorescence du donneur ainsi qu'une augmentation de l'intensité de fluorescence de l'accepteur. Ainsi, il est possible d'utiliser des capteurs qui mesurent l'intensité de fluorescence, afin d'évaluer par exemple le ratio donneur-accepteur ou l'augmentation de l'intensité de l'accepteur.

L'efficacité $E_{FRET}$ du transfert d'énergie est généralement définie par le changement d'intensité de fluorescence du donneur, soit

$E_{FRET}={\frac {P_{D\rightarrow A}}{P_{D}}}\qquad (11)$

En notant $P_{DA}$ la puissance émise par le donneur en présence de l'accepteur, et en utilisant $P_{D}=P_{D\rightarrow A}+P_{DA}$ , on peut réécrire l'équation ci-dessus et on a

$E_{FRET}=1-{\frac {P_{DA}}{P_{D}}}\qquad (12)$

On peut ainsi calculer directement l'efficacité du FRET en mesurant l'intensité de fluorescence du donneur seul et du donneur en présence de l'accepteur.

Temps de vie de fluorescence

Le FRET induit aussi une diminution de la durée de vie de fluorescence $\tau$ du donneur. Cette durée, qui correspond à une mesure du temps pendant lequel une molécule fluorescente reste dans son état excité après l'absorption d'un photon, est généralement de l'ordre de la nanoseconde. Des techniques, comme le Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC), permettent de mesurer cette durée de vie de fluorescence.

L'efficacité de FRET définie par l'équation (11) se calcule directement par

$E_{FRET}=1-{\frac {\tau _{DA}}{\tau _{D}}}\qquad (13)$

L'efficacité du FRET se calcule ainsi directement à partir de la durée de vie du donneur seul $\tau _{D}$ et celle du donneur en présence de l'accepteur $\tau _{DA}$.

Cette méthode, appelée Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), a pour avantages d'être indépendante des concentrations en molécules fluorescentes et du chemin de la lumière. Les images présentent un bon rapport signal sur bruit, mais les temps d'acquisitions sont souvent longs.

Photoblanchiment

Le photoblanchiment est un phénomène conduisant à la perte de fluorescence d'une molécule. Il est dû à une réaction photochimique, notamment avec l'oxygène, qui va empêcher le retour de l'émetteur fluorescent à un état excitable. Ce phénomène dépend de l’intensité de l'excitation ; plus l'échantillon est excité, plus la proportion de molécules fluorescentes photoblanchie est grande. Il est à noter que les cinétiques de photoblanchiment sont propres à chaque molécule fluorescente.

Pratiquement, le temps moyen de photoblanchiment du donneur en présence et en absence de l'accepteur est mesuré et comparé. Le FRET, en transférant l'énergie du donneur à l'accepteur, empêche le photoblanchiment du donneur car celui ci se trouve moins longtemps dans son état excité. Ainsi, des taux de transfert FRET importants conduisent à une constante de temps de photoblanchiment plus importante.

Les constantes de temps de photoblanchiment relatives au donneur seul $\tau '_{D}$ et au donneur en présence de l'accepteur $\tau '_{DA}$ sont utilisées pour calculer le rendement du FRET :

$E_{FRET}=1-{\frac {\tau '_{D}}{\tau '_{DA}}}\qquad (14)$

Les principaux avantages de cette méthode résident dans les durées engagées, qui sont de l'ordre de la seconde et non de la nanoseconde comme pour la FLIM. Cela constitue un avantage considérable pour la mesure, tant au niveau de la précision que du coût du matériel. De plus, le temps moyen de photoblanchiment ne dépend pas de la concentration en donneur, à moins que la concentration en accepteur soit trop faible et qu'il y ait saturation de l'accepteur. Cependant, il est important de garder la même intensité de rayonnement incident, afin d'avoir des mesures comparables. De plus, cette méthode peut seulement s'appliquer sur des échantillons fixes, et non in vivo comme pour les détections directes d'intensité ou de temps de vie de fluorescence.

Applications

Le principal intérêt du FRET est qu'il rend accessible des informations sur des échelles de distances très courtes, habituellement inaccessibles par les méthodes classiques de microscopie confocale ou électronique. Les principales applications du phénomène se retrouvent en biologie et en microscopie.

Applications en biologie

Le FRET trouve ses applications principales en biologie. La distance étant un facteur déterminant l'intensité du signal FRET, celui-ci peut permettre d'étudier la structure de protéines ou de molécules d'ADN, mais aussi leurs changements de conformation ainsi que la dynamique des interactions entre molécules.

Pratiquement, des marqueurs fluorescents sont insérés sur des sites d'intérêt de la particule étudiée. Des tests doivent alors être effectués afin de déterminer si le marquage de la particule modifie ses propriétés. La mesure de l'intensité du signal FRET permet d'avoir une évaluation relativement précise de la distance séparant les deux marqueurs, à condition que celle ci soit du même ordre de grandeur que le rayon de Förster $R_{0}$ du système.

Les changements de structure, et particulièrement des hydrolyses de molécules d'ADN (nucléase) ou de protéines (protéase) peuvent être détectés par une diminution de signal FRET. Les changements de conformations sont détectés par une modification de l'intensité du signal FRET, à condition que le changement de conformation entraîne une modification de la distance entre les deux sites marqués. Enfin, les interactions entre protéines, comme entre le calcium et la calmoduline, peuvent être visualisées grâce à l'augmentation du signal FRET résultant de leur complexation.

Applications en microscopie à balayage

Le FRET peut également trouver des applications en microscopie, en utilisant le couplage dipôle-dipôle présent entre la sonde et l'échantillon pour créer et enregistrer un signal qu'il sera possible d'interpréter. Cet effet, présent avec n'importe quel type de sonde située suffisamment près de l'échantillon, est souvent indésirable. Il est cependant possible d'en tirer parti, notamment en utilisant l'extinction de fluorescence d'une molécule près d'une surface métallique (quenching) ou en enregistrant un signal FRET entre la sonde et l'échantillon.

Cependant, cette approche pose plusieurs problèmes. D'une part, l’interaction doit se faire seulement avec un faible nombre de donneurs et d'accepteurs. Pour un nombre de paires trop important, étant donné le faible rayon d'action du FRET, seulement certaines contribueront au signal utile et toutes les autres augmenteront le bruit, par excitation directe de l'accepteur ou réabsorption du donneur. Pour un nombre de paires trop faibles, les problèmes d'extinction de fluorescence temporaire (blinking) ou permanente (photoblanchiment) deviennent prédominants. Dans ce contexte, des molécules fluorescentes photostables seraient d'une grande utilité. Il apparaît qu'il est préférable de placer les accepteurs sur la sonde, ceux-ci ne pouvant alors plus être excités directement par le laser. Le risque de photoblanchiment est alors réduit.

Ainsi, pratiquement, les donneurs sont situés sur l'échantillon et les accepteurs sont présents sur la sonde. La sonde scanne la surface et enregistre l'intensité du signal FRET. Des expériences utilisant des échantillons divisés en plusieurs couches, possédant chacune des donneurs, permettent de mettre en évidence l’interaction de très faible distance entre la sonde et l'échantillon. En effet, il devient alors possible de distinguer la couche extérieure des couches inférieures.

La résolution spatiale est souvent limitée à quelques centaines de nanomètres à cause de la taille de la sonde. Ce mode de microscopie possède intrinsèquement le potentiel pour accéder à des résolutions beaucoup plus faibles, de l'ordre de quelques nanomètres.

Exemple

On considère dans cet exemple un FRET entre deux molécules fluorescentes, la fluorescéine, qui sera le donneur, et Alexa Fluor 532, qui sera l'accepteur.

Détermination du rayon de Förster

A température ambiante, les spectres d'émission et d'absorption de la fluorescéine et d'Alexa Fluor 532 sont bien représentés par des distributions gaussiennes. A partir de ces données, il est possible d'évaluer le recouvrement spectral entre l'émission du donneur et l'absorption de l'accepteur.

On suppose que le milieu est non dispersif, c'est-à-dire que $n$ ne dépend pas de $\omega$. En prenant comme valeur $n=1.33$ qui est l'indice optique de l'eau, et en prenant pour $\kappa ^{2}$ la valeur moyennée sur les orientations donnée par l'équation (9), le rayon de Förster $R_{0}$ se calcule grâce à l'équation (6) par

$R_{0}=\left[{\frac {9c^{4}(2/3)}{8\pi 1.33^{4}(2\pi c)^{4}}}\int _{0}^{\infty }{f_{D}(\lambda )\sigma _{A}(\lambda )\lambda ^{4}d\lambda }\right]^{1/6}\qquad (15)$

L'évaluation numérique de l'intégrale de recouvrement apparaissant dans l'expression de $R_{0}$ donne un rayon de Förster de 6.3 nm. Dans l'air, pour $n=1$, on obtient un rayon de Förster de 7.6 nm. On observe ici une forte dépendance du FRET au milieu, avec des distances autorisées plus importantes entre donneur et accepteur pour un faible indice optique.

Résultats expérimentaux

Afin de mesurer expérimentalement le FRET entre ces deux molécules fluorescentes, il faut d'abord exciter le donneur. La longueur d'onde choisie est $\lambda _{exc}=488$ nm, qui correspond au pic d'absorption du donneur, la fluorescéine. Ainsi, on maximise l'énergie d'excitation absorbée par le donneur. Une partie de l'énergie d'excitation est également directement absorbée par l'absorbeur. Cela va induire un signal de fluorescence de fond pour l'absorbeur, qu'il est possible de filtrer. Ici, à $\lambda _{exc}$, l’absorption du donneur est quatre fois plus importante que celle de l'absorbeur.

Théoriquement, pour $R=R_{0}$, l'émission du donneur vaut la moitié de son émission en l'absence de l'accepteur. L'intensité de fluorescence de l'accepteur, de son coté, décroît selon $R^{6}$. Pour des distances très faibles, celle-ci sature à un niveau déterminé par la durée de vie de l'état excité de l'accepteur.

Pour une distance de 6.3 nm, la fluorescence du donneur est deux fois plus faible que pour une longueur d'onde de 12 nm, pour laquelle l'influence de l'accepteur devient négligeable. La valeur de la fluorescence de l'absorbeur est non nulle pour une distance de 12 nm, alors que le FRET est négligeable. La fluorescence de fond de l'absorbeur due à une absorption directe du rayonnement d'excitation est en cause.

Le FRET est observable à travers la diminution de fluorescence du donneur ou l'augmentation de fluorescence de l'absorbeur. L'efficacité $E_{FRET}$ du transfert d'énergie est définie selon la formule (11) par le changement d'intensité de fluorescence du donneur, et on peut écrire

$E_{FRET}={\frac {P_{D\rightarrow A}}{P_{0}}}={\frac {1}{1+(R/R_{0})^{6}}}\qquad (16)$

Expérimentalement, le donneur et l'accepteur ont été attachés à une molécule d'ADN. La fluorescence de ces deux molécules a été mesurée sur des périodes de 8 ms. Pendant les intervalles de temps pour lesquels le signal de l'accepteur est non nul, le signal provenant du donneur est beaucoup moins intense, ce qui est une preuve que l’énergie du donneur a été transférée à l'accepteur par FRET. Ainsi, l'efficacité du FRET est parfois de 0 et parfois de 0.7. On peut en conclure que la molécule d'ADN alterne régulièrement entre deux conformations différentes, pour lesquelles les marqueurs fluorescents sont à des distances différentes. Selon la théorie, lorsqu'aucun signal FRET n'est relevé, les deux fluorophores sont au moins distants de 12 nm. Pour une efficacité de FRET de $E_{FRET}=0.7$ et en utilisant $R_{0}=6.3$ nm, l'inversion de la formule (12) prédit une distance $R=5.6$ nm entre le donneur et l'accepteur.

Ce résultat est cependant entaché d'une incertitude relativement importante. Cela est dû en particulier à l'utilisation de la valeur de $\kappa ^{2}$ moyennée sur toutes les orientations. Cette valeur peut varier dans l'intervalle $\kappa ^{2}$ = [0...4]. Pour quantifier précisément la distance $R$ entre les deux dipôles, il serait alors nécessaire de déterminer l'orientation relative des dipôles correspondant au donneur et à l'accepteur.

Conclusion

Le FRET est ainsi un phénomène physique permettant d'accéder avec des instruments d'optique à des résolutions très importantes, de l'ordre de quelques nanomètres, bien en dessous de la limite de diffraction. Cette particularité permet de nombreuses applications en biologie et en microscopie à balayage.

Le développement de nouveaux émetteurs fluorescents moins sensibles au photoblanchiment ainsi que de nouveaux détecteurs plus performants pourraient améliorer les performances des dispositifs utilisant le FRET. Ces derniers pourraient également être utilisés en association avec d'autres techniques de microscopie, comme la Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM), afin d'en augmenter ses performances.