Cryomicroscopie électronique

La cryomicroscopie électronique (cryo-ME) correspond à une technique particulière de préparation d’échantillons biologiques utilisée en microscopie électronique en transmission. Développée au début des années 1980, cette technique permet de réduire les dommages d’irradiation causés par le faisceau d’électrons. Elle permet également de préserver la morphologie et la structure des échantillons.

Microscope cryoélectronique à transmission (cryo-MET) équipé d’un système de refroidissement cryogénique et d’une station de contrôle informatique.

S’affranchissant de la présence de colorant ou de fixateur chimique, cette technique consiste à congeler très rapidement des échantillons biologiques sous forme hydratés dans de l’éthane liquide, de manière à les figer dans leur état natif dans une glace amorphe c'est-à-dire non cristalline.

Avec le développement continu de nouvelles générations de microscopes électroniques et de systèmes d’acquisition des données (notamment le développement de caméras à détection directe d’électrons), la cryo-ME permet désormais dans certains cas d’obtenir des résultats similaires, voire supérieurs, à ceux de la cristallographie aux rayons X pour la résolution de structures tridimensionnelles (3D) d’objets biologiques.

Développement

Jacques Dubochet devant un microscope électronique en transmission (Philips CM100). Université de Lausanne, 2000.

La microscopie électronique, développée dans les années 1930, a permis d'observer l'ultrastructure des cellules, des organites et des virus. Cependant, l'étude des échantillons biologiques nécessitait généralement une fixation chimique, une déshydratation et une coloration aux métaux lourds, susceptibles d'altérer leur structure naturelle. L'exposition au faisceau d'électrons pouvait également provoquer des dommages liés à l'irradiation.

Au début des années 1980, le biophysicien suisse Jacques Dubochet et ses collaborateurs ont développé une méthode de préparation permettant de refroidir très rapidement les échantillons biologiques dans de l'éthane liquide. Cette technique, appelée vitrification, empêche la formation de cristaux de glace et préserve les biomolécules dans un état proche de leur structure native. En 1984, l'équipe de Dubochet a publié des images de plusieurs virus conservés dans de la 'glace vitreuse'.

Pendant longtemps, la résolution de la cryomicroscopie électronique est restée limitée. À partir de 2012, l'introduction de détecteurs directs d'électrons, associée aux progrès du traitement informatique des images, a permis d'atteindre une résolution proche de l'échelle atomique. Cette avancée, appelée « révolution de la résolution », a fait de la cryomicroscopie électronique une technique majeure de la biologie structurale.

Le 4 octobre 2017, le Prix Nobel de chimie a été remis conjointement à Jacques Dubochet, Joachim Frank et Richard Henderson, « pour le développement de la cryomicroscopie électronique permettant la détermination à haute résolution de la structure des biomolécules en solution ».

Principe

La cryo-ME permet d’effectuer des études structurales de complexes macromoléculaires biologiques avec un nombre de contraintes beaucoup moins élevé que pour la diffraction aux rayons X. Contrairement à d’autres techniques de préparation (dont la coloration négative), aucun colorant ou fixateur chimique n’est utilisé. De plus, le complexe macromoléculaire peut rester dans un environnement (tampon) proche de ses conditions physiologiques (en termes de pH et de concentration en sel). La congélation rapide des échantillons dans de l’éthane liquide (−160 °C) fige ces derniers dans leur état natif dans une glace amorphe. Les images obtenues étant des projections 2D de l’ensemble des objets congelés, ceci permet d’accéder à la structure interne de macromolécules complexes. L’utilisation de la cryomicroscopie (manipulation et maintien des échantillons à basse température) multiplie la durée de vie de l’échantillon sous le faisceau d’électrons par un facteur deux ou trois.

Films minces / Échantillons congelés hydratés

Virus en suspension dans un trou au sein d'une couche de glace amorphe.

Dans le cas d’échantillons biologiques de faible épaisseur (particules isolées < 500 nm), quelques μL d’échantillon sont déposés sur une grille de microscopie électronique (grille recouverte d’une membrane à trous faite de carbone, or, etc.). Avant congélation, l’excédent de matériel est absorbé avec un papier filtre. La grille est ensuite plongée très rapidement (vitesse supérieure à 2 m/s) dans de l’éthane liquide. L’échantillon, à l’état natif, se retrouvera congelé dans les trous au sein d’une couche de glace amorphe très mince.

Une fois transférée dans le microscope, la grille maintenue à la température de l’azote liquide (−185 °C) est observée. Afin de limiter les dommages d’irradiation, de faibles doses d’électrons sont utilisées. Les images obtenues sont des projections de toute l’épaisseur de l’échantillon mais ne possèdent cependant qu’un contraste très faible (indirectement lié à la différence de densité entre une protéine et la glace vitreuse, 1,3 g/mL vs 1 g/mL). Afin de déterminer la structure de l’échantillon, une analyse d’images est alors indispensable. Le principe général consiste dans un premier temps à additionner des images identiques de faible contraste afin de moyenner le bruit présent et d’obtenir un meilleur rapport signal sur bruit. Dans un deuxième temps, ces moyennes qui représentent des vues de l’échantillon sous différents angles peuvent être combinées de manière mathématique pour calculer la structure tridimensionnelle de l’objet.

Coupes / Sections congelées hydratées (CEMOVIS)

Les échantillons biologiques, comme des cellules ou des bactéries (> 1 μm), peuvent être observées par cryo-ME sous forme de sections congelées hydratées. Les échantillons sont dans un premier temps cryo-fixés (généralement par congélation sous haute pression), puis coupés en sections minces (coupes de 40 à 200 nm d’épaisseur) à l’aide d’un cryo-ultramicrotome. L’observation et la prise d’images se font par la suite comme pour les échantillons congelés hydratés.

Voir aussi

Bibliographie

• Boutin, J. A., Li, Z., Vuillard, L., & Vénien-Bryan, C. (2016). La cryo-microscopie, une alternative à la cristallographie aux rayons X?. médecine/sciences, 32(8-9), 758-767
• Neumann, E., Estrozi, L. F., Effantin, G., Breyton, C., & Schoehn, G. (2017). Prix Nobel de Chimie 2017: Jacques Dubochet, Joachim Frank et Richard Henderson La révolution de la résolution en cryo-microscopie électronique |medecinesciences.org

• Ressource relative à la santé :
  • Medical Subject Headings
• Notice dans un dictionnaire ou une encyclopédie généraliste :

  • Store norske leksikon