Alors qu'une profession de foi - signée de sa main deux jours avant qu’il rallie la cause du Brexit - glorifiait l’« aubaine » que serait un vote en faveur du maintien dans l’Union et annonçait un « choc économique » en cas de Brexit<ref name="r1" />, il fait volte-face et annonce, le 21 février 2016, qu'il souhaite la [[Débats sur le retrait du Royaume-Uni de l'Union européenne|sortie du Royaume-Uni de l'Union européenne]]. S'opposant ainsi à la majorité des personnalités du Parti conservateur, il devient le porte-parole officiel de la campagne du « Brexit »<ref>
[https://www.lemonde.fr/economie/article/2016/02/22/boris-johnson-chez-les-pro-brexit-revers-pour-cameron_4869346_3234.html www.lemonde.fr]</ref>{{,}}<ref>[http://www.lexpress.fr/actualite/monde/europe/quelle-place-en-europe-pour-le-royaume-uni-les-pro-brexit-dans-le-brouillard_1807042.html Quelle place en Europe pour le Royaume-Uni : les pro-Brexit dans le brouillard], ''L'Express''.</ref>. À la suite du [[Référendum sur le maintien du Royaume-Uni dans l'Union européenne|référendum du 23 juin 2016]], à l'issue duquel une courte majorité de Britanniques se prononceprononcent en faveur du départ du pays de l'UE, il apparaît comme un des grands gagnants du scrutin et fait figure de favori pour succéder au Premier ministre [[David Cameron]], qui a annoncé son intention de démissionner d'ici au mois d'octobre<ref>[http://www.lepoint.fr/europe/quoi-qu-il-arrive-boris-johnson-est-devenu-incontournable-23-06-2016-2049145_2626.php Quoi qu'il arrive, Boris Johnson est devenu incontournable], ''Le Point'', 23 juin 2016.</ref>{{,}}<ref>[https://www.francetvinfo.fr/monde/europe/la-grande-bretagne-et-l-ue/brexit-boris-johnson-futur-premier-ministre_1517549.html La Grande-Bretagne et l'UE : Boris Johnson futur Premier ministre?], ''francetvinfo.fr''.</ref>. Mais il doit faire face à des critiques sur sa capacité à rassembler le parti, très divisé à l'issue de ce référendum, et renonce finalement à se présenter à l'[[Élection à la direction du Parti conservateur de 2016|élection à la direction du Parti conservateur]]<ref>{{Lien web|auteur=|titre=Brexit : Boris Johnson renonce à se présenter à la succession de Cameron|jour=|mois=|année=|url=http://www.lexpress.fr/actualite/monde/europe/boris-johnson-renonce-a-se-presenter-a-la-succession-de-cameron_1807760.html|site=LExpress.fr|en ligne le=|consulté le=4 juillet 2016}}.</ref>, soutenant quelques jours plus tard la candidature d'[[Andrea Leadsom]]<ref>Jamie Bullen, [https://www.standard.co.uk/news/politics/boris-johnson-backs-andrea-leadsom-in-conservative-party-leadership-race-a3287826.html « Boris Johnson backs Andrea Leadsom in Conservative Party leadership race »], standard.co.uk, 4 juillet 2016.</ref>.
